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PCR儀的兩大誤區我們要注意了!

發(fā)布時(shí)間: 2022-01-19  點(diǎn)擊次數: 997次
   PCR儀重要的就是升降溫過(guò)程,起初的水浴鍋式PCR,就是三個(gè)水浴箱,一個(gè)機械臂,定時(shí)抓出反應槽轉換水浴鍋。這種儀器體積大,迅速慢,但其實(shí)結果并不比以后的PCR儀差。后來(lái)有人利用致冷和加熱做成了固定位置升降溫的PCR擴增儀。后來(lái)隨著(zhù)定量技術(shù)的發(fā)展,有將擴增儀和檢測做成一體,也就成了現在的實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。
  PCR儀的兩大誤區分析:
  1.儀器通道越多越好
  隨著(zhù)PCR技術(shù)的成熟運用,熒光定量PCR儀也是如此。從單通道熒光定量PCR儀發(fā)展到如今各個(gè)廠(chǎng)家都推出4通道、5通道甚至6通道熒光定量PCR儀,眼花繚亂的選擇讓人無(wú)所適從,稍不小心就可能走進(jìn)“通道越多越好”的誤區。
  在使用有些5通道的熒光定量PCR儀時(shí),為了確保實(shí)驗結果的精確性和準確性都要在實(shí)驗中使用ROX(一種熒光染料),這些熒光染料都必須單獨使用一個(gè)檢測通道。這樣以來(lái),真正能檢測多重PCR熒光信號的有效通道只有4個(gè),而且使用校正染料可能會(huì )增加后期的使用成本。有的熒光定量PCR的檢測通道是只為自已廠(chǎng)家的專(zhuān)用的熒光染料或試劑開(kāi)放的,有效檢測通道也絕非像宣傳的那么多。因此在購買(mǎi)前確認熒光定量PCR儀器的有效檢測通道尤為重要。
  2.real-time PCR儀無(wú)需梯度功能
  對于使用染料法的定量PCR反應,雖然有各種各樣的PCR引物設計軟件或者經(jīng)驗公式計算熔解溫度(Tm值),但運用的公式不同、引物序列不同,Tm值的差異會(huì )很大。引物的熔解溫度決定了退火溫度。而且模版中堿基的組合千變萬(wàn)化,對于特殊片斷,經(jīng)驗公式得到的數據不一定能得出準確的結果,退火溫度細微的差異對結果都可能產(chǎn)生決定性的影響,因而“摸條件”一度是讓人很頭疼的問(wèn)題。梯度PCR的出現部分解決了一些問(wèn)題-在反應過(guò)程中每個(gè)孔的溫度控制條件可以在規定范圍內按照梯度變化,根據結果,一步就可以摸索出適合的反應條件。
  不單退火溫度,連變性溫度和延伸溫度都可以?xún)?yōu)化-對于多種聚合酶混合酶擴增來(lái)說(shuō)這個(gè)非常重要,因為T(mén)aq和校正酶的佳反應溫度可能有顯著(zhù)差異,優(yōu)化延伸溫度就顯得很重要。
  使用有梯度功能的熒光定量PCR儀可以一次完成以往多次實(shí)驗才能完成的優(yōu)化過(guò)程,簡(jiǎn)化了摸索PCR反應條件的繁瑣實(shí)驗,既節省實(shí)驗時(shí)間提高效率,又節省實(shí)驗成本。
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